Цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот – ЦТК, цикл Кребса) представляет собой серию реакций, протекающих в митохондриях, в ходе которых осуществляется катаболизм ацетильных групп и высвобождение восстановительных эквивалентов; при окислении последних в ЭТЦ поставляется свободная энергия, кумулируемая в АТФ. Цикл запускается оксалоацетатом, который синтезируется из ПВК под действием пируваткарбоксилазы.
Молекула ацетил-КоА, полученная в окислительном декарбоксилировании ПВК и β-окислении ВЖК, взаимодействует с ОА; в результате генерируется 6-тиуглеродная трикарбоновая кислота — лимонная (цитрат) (Рис. 3.8). Далее в серии реакций происходит высвобождение двух молекул углекислого газа и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество последнего, необходимое для преобразования большого числа ацетильных групп, весьма невелико, можно считать, что это соединение выполняет каталитическую функцию.
В ЦТК, благодаря активности ряда специфических дегидрогеназ, происходит образование восстановительных эквивалентов в форме протонов и электронов, индуцирующих дыхательную цепь, при функционировании которой синтезируется АТФ
Образование макроэргических соединений в ЦТК
| Окисляемый
субстрат |
Фермент,
катализирующий |
Место образования макроэргов и характер сопряженного процесса | Число синтезированных молекул АТФ |
| Изоцитрат | ИзоцитратДГ | 3 | |
| α-Кетоглутарат | α–кетоглутаратДГ | Окисление НАДН в дыхательной цепи | 3 |
| Сукцинилфосфат | Сукцинаттиокиназа | Синтез АТФ на субстратном уровне | 1 |
| Сукцинат | СукцинатДГ | Окисление ФАДН 2 в дыхательной цепи | 2 |
| Малат | МалатДГ | Окисление НАДН в дыхательной цепи | 3 |
| Итого | 12 | ||
Таким образом, каждый цикл обеспечивает синтез 12 молекул макроэргов.
Биологические функции цикла Кребса
ЦТК является общим конечным путем окислительного распада углеводов, липидов, белков, поскольку в ходе метаболизма глюкоза, ЖК, глицерин, аминокислоты и ациклические азотистые основания превращаются либо в ацетил–КоА, либо в метаболиты этого процесса, являющиеся источниками восстановительных эквивалентов, запускающих ЭТЦ и окислительное фосфорилирование, тем самым обеспечиваются энергетические запросы различных органов и тканей, и постоянная температура тела. Эндогенная вода образуется также, как известно, за счет биологического окисления, субстратами которого служат метаболиты ЦТК. Промежуточные продукты ЦТК могут использоваться в анаболизме: ОА и его предшественники служат субстратами в ГНГ; из α–кетоглутарата и ОА с помощью переаминирования легко получить аминокислоты; сукцинил–КоА необходим для синтеза гема; избыточный цитрат, выйдя из митохондрий, отщепляет ацетил-КоА, из которого генерируются ВЖК, ХС, ацетилхолин, производные моносахаридов (мономеров гетерополисахаридов).
У человека не описаны генетически обусловленные повреждения ферментов, катализирующих его различные стадии, т.к. возникновение подобных нарушений несовместимо с нормальным развитием организма.
Образующийся в ПВК-дегидрогеназной реакции ацетил-SКоА далее вступает в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК, цикл лимонной кислоты, цикл Кребса). Кроме пирувата, в цикл вовлекаются кетокислоты, поступающие из катаболизма аминокислот или каких-либо иных веществ.
Цикл трикарбоновых кислот
Цикл протекает в матриксе митохондрий и представляет собой окисление молекулы ацетил-SКоА в восьми последовательных реакциях.
В первой реакции связываются ацетил и оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота) с образованием цитрата (лимонной кислоты), далее происходит изомеризация лимонной кислоты до изоцитрата и две реакции дегидрирования с сопутствующим выделением СО 2 и восстановлением НАД.
В пятой реакции образуется ГТФ, это реакция субстратного фосфорилирования . Далее последовательно происходит ФАД-зависимое дегидрирование сукцината (янтарной кислоты), гидратация фумаровой кислоты до малата (яблочная кислота), далее НАД-зависимое дегидрирование с образованием в итоге оксалоацетата .
В итоге после восьми реакций цикла вновь образуется оксалоацетат.
Последние три реакции составляют так называемый биохимический мотив (ФАД-зависимое дегидрирование, гидратация и НАД-зависимое дегидрирование, он используется для введения кетогруппы в структуру сукцината. Этот мотив также присутствует в реакциях β-окисления жирных кислот . В обратной последовательности (восстановление, де гидратация и восстановление) этот мотив наблюдается в реакциях синтеза жирных кислот .
Функции ЦТК
1. Энергетическая
- генерация атомов водорода для работы дыхательной цепи , а именно трех молекул НАДН и одной молекулы ФАДН2 ,
- синтез одной молекулы ГТФ (эквивалентна АТФ).
2. Анаболическая . В ЦТК образуются
- предшественник гема – сукцинил-SКоА ,
- кетокислоты, способные превращаться в аминокислоты – α-кетоглутарат для глутаминовой кислоты, оксалоацетат для аспарагиновой,
- лимонная кислота , используемая для синтеза жирных кислот ,
- оксалоацетат , используемый для синтеза глюкозы .
Анаболические реакции ЦТК
Регуляция цикла трикарбоновых кислот
Аллостерическая регуляция
Ферменты, катализирующие 1-ю, 3-ю и 4-ю реакции ЦТК, являются чувствительными к аллостерической регуляции метаболитами:
Регуляция доступностью оксалоацетата
Главным и основны регулятором ЦТК является оксалоацетат , а точнее его доступность. Наличие оксалоацетата вовлекает в ЦТК ацетил-SКоА и запускает процесс.
Обычно в клетке имеется баланс между образованием ацетил-SКоА (из глюкозы, жирных кислот или аминокислот) и количеством оксалоацетата. Источником оксалоацетата является пируват , (образуемый из глюкозы или аланина), получение из аспарагиновой кислоты в результате трансаминирования или цикла АМФ-ИМФ, и также поступление из фруктовых кислот самого цикла (янтарной, α-кетоглутаровой, яблочной, лимонной), которые могут образоваться при катаболизме аминокислот или поступать из других процессов.
Синтез оксалоацетата из пирувата
Регуляция активности фермента пируваткарбоксилазы осуществляется при участии ацетил-SКоА . Он является аллостерическим активатором фермента, и без него пируваткарбоксилаза практически неактивна. Когда ацетил-SКоА накапливается, то фермент начинает работать и образуется оксалоацетат, но, естественно, только при наличии пирувата.
Также большинство аминокислот при своем катаболизме способны превращаться в метаболиты ЦТК, которые далее идут в оксалоацетат, чем также поддерживается активность цикла.
Пополнение пула метаболитов ЦТК из аминокислот
Реакции пополнения цикла новыми метаболитами (оксалоацетат, цитрат, α-кетоглутарат и т.п) называются анаплеротическими .
Роль оксалоацетата в метаболизме
Примером существенной роли оксалоацетата служит активация синтеза кетоновых тел и кетоацидоз плазмы крови при недостаточном количестве оксалоацетата в печени . Такое состояние наблюдается при декомпенсации инсулинзависимого сахарного диабета (СД 1 типа) и при голодании. При указанных нарушениях в печени активирован процесс глюконеогенеза , т.е. образования глюкозы из оксалоацетата и других метаболитов, что влечет за собой снижение количества оксалоацетата. Одновременная активация окисления жирных кислот и накопление ацетил-SКоА запускает резервный путь утилизации ацетильной группы – синтез кетоновых тел . В организме при этом развивается закисление крови (кетоацидоз ) с характерной клинической картиной: слабость, головная боль, сонливость, снижение мышечного тонуса, температуры тела и артериального давления.
Изменение скорости реакций ЦТК и причины накопления кетоновых тел при некоторых состояниях
Описанный способ регуляции при участии оксалоацетата является иллюстрацией к красивой формулировке "Жиры сгорают в пламени углеводов ". В ней подразумевается, что "пламень сгорания" глюкозы приводит к появлению пирувата, а пируват превращается не только в ацетил-SКоА, но и в оксалоацетат. Наличие оксалоацетата гарантирует включение ацетильной группы, образуемой из жирных кислот в виде ацетил-SКоА, в первую реакцию ЦТК.
В случае масштабного "сгорания" жирных кислот, которое наблюдается в мышцах при физической работе и в печени при голодании , скорость поступления ацетил-SКоА в реакции ЦТК будет напрямую зависеть от количества оксалоацетата (или окисленной глюкозы).
Если количество оксалоацетата в гепатоците недостаточно (нет глюкозы или она не окисляется до пирувата), то ацетильная группа будет уходить на синтез кетоновых тел . Такое происходит при длительном голодании и сахарном диабете 1 типа .
Продолжаем разбирать цикл Кребса. В прошлой статье я рассказывал о том, что это вообще такое, для чего цикл Кребса нужен и какое место в метаболизме он занимает. Теперь давайте приступим к самим реакциям этого цикла.
Сразу оговорюсь - лично для меня заучивание реакций было совершенно бессмысленным занятием до того, пока я не разобрал вышеуказанные вопросы. Но если вы уже разобрались с теорией, предлагаю перейти к практике.
Вы можете увидеть множество способов написания цикла Кребса. Чаще всего встречаются варианты вроде этого:
Но мне удобнее всего показался способ написания реакций из старого доброго учебника по биохимии от авторов Берёзова Т.Т. и Коровкина Б.В.
Уже знакомые нам Ацетил-КоА и Оксалоацетат соединяются и превращаются в цитрат, то есть в лимонную кислоту .
Вторая реакция
Теперь берём лимонную кислоту и превращаем её изолимонную кислоту . Другое название этого вещества - изоцитрат.
На самом деле, эта реакция идёт несколько сложнее, через промежуточную стадию - образование цис-аконитовой кислоты. Но я решил упростить, чтобы вы получше запомнили. При необходимости вы сможете добавить сюда недостающую ступень, если будете помнить всё остальное.
По сути, две функциональные группы просто поменялись местами.
Третья реакция
Итак, у нас получилась изолимонная кислота. Теперь её нужно декарбоксилировать (то есть отщипнуть COOH) и дегидрировать (то есть отщипнуть H) . Получившееся вещество - это a-кетоглутарат .
Эта реакция примечательна тем, что здесь образуется комплекс HAДH2. Это значит, что переносчик НАД подхватывает водород, чтобы запустить дыхательную цепь.
Мне нравится вариант реакций Цикла Кребса в учебнике Берёзова и Коровкина именно тем, что сразу отлично видно атомы и функциональные группы, которые участвуют в реакциях.
Четвёртая реакция
Снова как часы работает никотинАмидАденинДинуклеотид, то есть НАД . Это славный переносчик появляется здесь, как и в прошлом шаге, чтобы захватить водород и унести его в дыхательную цепь.
Кстати, получившееся вещество - сукцинил-КоА , не должно вас пугать. Сукцинат - это другое название янтарной кислоты, хорошо знакомой вам со времён биоорганической химии. Сукцинил-Коа - это соединение янтарной кислоты с коэнзимом-А. Можно сказать, что это эфир янтарной кислоты.
Пятая реакция
В прошлом шаге мы говорили, что сукцинил-КоА - это эфир янтарной кислоты. А теперь мы получим саму янтарную кислоту , то есть сукцинат, из сукцинила-КоА. Крайне важный момент: именно в этой реакции происходит субстратное фосфорилирование .
Фосфорилирование вообще (оно бывает окислительное и субстратное) - это добавление фосфорной группы PO3 к ГДФ или АТФ, чтобы получить полноценный ГТФ , или соответственно, АТФ. Субстратное отличается тем, что эта самая фосфорная группа отрывается от какого-либо вещества, её содержащую. Ну проще говоря, она переносится с СУБСТРАТА на ГДФ или АДФ. Поэтому и называется - «субстратное фосфорилирование».
Ещё раз: на момент начала субстратного фосфорилирования у нас имеется дифосфатная молекула - гуанозинДифосфат или аденозинДифосфат. Фосфорилирование заключается в том, что молекула с двумя остатками фосфорной кислоты - ГДФ или АДФ «достраивается» до молекулы с тремя остатками фосфорной кислоты, чтобы получились гуанозинТРИфосфат или аденозинТРИфосфат. Этот процесс происходит во время превращения сукцинила-КоА в сукцинат (то есть, в янтарную кислоту).
На схеме вы можете увидеть буквы Ф (н). Это значит «неорганический фосфат». Неорганический фосфат переходит от субстрата на ГДФ, чтобы в продуктах реакции был хороший, полноценный ГТФ. Теперь давайте посмотрим на саму реакцию:
Шестая реакция
Следующее превращение. На сей раз янтарная кислота, которую мы получили в прошлом этапе, превратится в фумарат , обратите внимание на новую двойную связь.
На схеме отлично видно, как в реакции участвует ФАД : этот неутомимый переносчик протонов и электронов подхватывает водород и утаскивает его непосредственно в дыхательную цепь.
Седьмая реакция
Мы уже на финишной прямой.
ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ЦИКЛ КРЕБСА)
Предпоследняя стадия Цикла Кребса - это реакция превращения фумарата в L-малат. L-малат - это другое название L-яблочной кислоты , знакомой ещё с курса биоорганической химии.
Если вы посмотрите на саму реакцию, вы увидите, что, во-первых, она проходит в обе стороны, а во-вторых, её суть - гидратирование. То есть фумарат просто присоединяет к себе молекулу воды, в итоге получается L-яблочная кислота.
Восьмая реакция
Последняя реакция Цикла Кребса - это окисление L-яблочной кислоты до оксалоацетата, то есть до щавелевоуксусной кислоты . Как вы поняли, «оксалоацетат» и «щавелевоуксусная кислота» - это синонимы. Вы, наверное, помните, что щавелевоуксусная кислота является компонентом первой реакции цикла Кребса.
Здесь же отмечаем особенность реакции: образование НАДH2 , который понесёт электроны в дыхательную цепь. Не забудьте также реакции 3,4 и 6, там также образуются переносчики электронов и протонов для дыхательной цепи.
Как видите, я специально выделил красным цветом реакции, в ходе которых образуются НАДH и ФАДH2. Это очень важные вещества для дыхательной цепи. Зелёным я выделил реакцию, в рамках которой происходит субстратное фосфорилирование, и получается ГТФ.
Как это всё запомнить?
На самом деле, не так уж и сложно. Полностью прочитав две моих статьи, а также ваш учебник и лекции, вам нужно просто потренироваться писать эти реакции. Я рекомендую запомнить цикл Кребса блоками по 4 реакции. Напишите эти 4 реакции несколько раз, для каждой подбирая ассоциацию, подходящую именно вашей памяти.
Например, мне сразу очень легко запомнилась вторая реакция, в которой из лимонной кислоты (она, думаю, всем знакома с детства) образуется изолимонная кислота.
Вы можете так же использовать мнемонические запоминалки, такие как: «Целый Ананас И Кусочек Суфле Сегодня Фактически Мой Обед , что соответствует ряду - цитрат, цис -аконитат, изоцитрат, альфа-кетоглутарат, сукцинил-CoA, сукцинат, фумарат, малат, оксалоацетат». Есть ещё куча подобных.
Но, если честно, мне не нравились такие стихи практически никогда. По-моему, проще запомнить саму последовательность реакций. Мне отлично помогло разделение цикла Кребса на две части, каждую из которых я тренировался писать по несколько раз в час. Как правило, это происходило на парах вроде психологии или биоэтики. Это весьма удобно - не отвлекаясь от лекции, вы можете потратить буквально минутку, написав реакции так, как вы их запомнили, а затем сверить с правильным вариантом.
Кстати, в некоторых вузах на зачётах и экзаменах по биохимии преподаватели не требуют знания самих реакций. Нужно знать только что такое цикл Кребса, где он происходит, в чём его особенности и значение, и, разумеется, саму цепочку превращений. Только цепочку можно называть без формул, используя лишь названия веществ. Такой подход не лишён смысла, на мой взгляд.
Надеюсь, моё руководство по циклу трикарбоновых кислот вам помогло. А я хочу напомнить, что эти две статьи не являются полноценной заменой вашим лекциям и учебникам. Я написал их лишь для того, чтобы вы примерно понимали, что такое цикл Кребса. Если вы вдруг увидели какую-то ошибку в моём руководстве, пожалуйста, отпишитесь о ней в комментариях. Спасибо за внимание!
Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Кребсом. Он первым постулировал значение данного цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является гликолитическое превращение углеводов. В дальнейшем было показано, что цикл трикарбоновых кислот является "фокусом", в котором сходятся практически все метаболические пути.
Итак, образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата ацетил-КоА вступает в цикл Кребса. Данный цикл состоит из восьми последовательных реакций (рис. 91). Начинается цикл с конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом и образования лимонной кислоты. (Как будет видно ниже, в цикле окислению подвергается собственно не ацетил-КоА, а более сложное соединение — лимонная кислота (трикарбоновая кислота). )
Затем лимонная кислота (шестиуглеродное соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода) и дскарбоксилирований (отщепление СО2) теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса появляется оксалоацетат (четырехуглеродное соединение), т. е. в результате полного оборота цикла молекула ацетил-КоА сгорает до СО2 и Н2О, а молекула оксалоацетата регенерируется. Ниже приводятся все восемь последовательных реакций (этапов) цикла Кребса.
В первой реакции, катализируемой ферментом цитратсинтазой, ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом. В результате образуется лимонная кислота:
По-видимому, в данной реакции в качестве промежуточного продукта образуется связанный с ферментом цитрил-КоА. Затем последний самопроизвольно и необратимо гидролизуется с образованием цитрата и HS-KoA.
Во второй реакции цикла образовавшаяся лимонная кислота подвергается дегидратированию с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту. Катализирует эти обратимые реакции гидратации-дегидратации фермент аконитат-гидратаза:
В третьей реакции, которая, по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса, изолимонная кислота дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы:
(В тканях существует два типа изоцитратдегидрогеназ: НАД- и НАДФ-зависимые. Установлено, что роль основного катализатора окисления изолимонной кислоты в цикле Кребса выполняет НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа. )
В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg2+ или Мn2+.
В четвертой реакции происходит окислительное декарбоксилирование α-кетоглутаровой кислоты до сукцинил-КоА. Механизм этой реакции сходен с реакцией окислительного декарбоксилирования пирувата до ацетил-КоА. α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс напоминает по своей структуре пируватдегидрогеназный комплекс. Как в одном, так и в другом случае в ходе реакции принимают участие пять коферментов: TДФ, амид липоевой кислоты, HS-KoA, ФАД и НАД. Суммарно данную реакцию можно написать так:
Пятая реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой. В ходе этой реакции сукцинил-КоА при участии ГДФ и неорганического фосфата превращается в янтарную кислоту (сукцинат). Одновременно происходит образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ1 за счет высокоэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА:
(Образовавшийся ГТФ отдает затем свою концевую фосфатную группу на АДФ, вследствие чего образуется АТФ. Образование высокоэргического нуклеозидтрифосфата в ходе сукцинил-КоА-синтетазной реакции — пример фосфорилирования на уровне субстрата. )
В шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту. Окисление сукцината катализируется сукцинатдегидрогеназой, в молекуле которой с белком ковалентно связан кофермент ФАД:
В седьмой реакции образовавшаяся фумаровая кислота гидратируется под влиянием фермента фумаратгидратазы. Продуктом данной реакции является яблочная кислота (малат). Следует отметить, что фумаратгидратаза обладает стереоспецифичностью, — в ходе данной реакции образуется L-яблочная кислота:
Наконец, в восьмой реакции цикла трикарбоновых кислот под влиянием митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы происходит окисление L-малата в оксалоацетат:
Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление ("сгорание") одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов (или в цепи дыхательных ферментов), локализованной в митохондриях.
Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ. Из четырех пар атомов водорода три пары переносятся через НАД на систему транспорта электронов; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуются три молекулы АТФ (в процессе сопряженного окислительного фосфорилирования), а всего, следовательно, девять молекул АТФ. Одна пара атомов попадает в систему транспорта электронов через ФАД, — в результате образуются 2 молекулы АТФ. В ходе реакций цикла Кребса синтезируется также 1 молекула ГТФ, что равносильно 1 молекуле АТФ. Итак, при окислении ацетил-КоА в цикле Кребса образуется 12 молекул АТФ.
Как уже отмечалось, 1 молекула НАДН2 (3 молекулы АТФ) образуется при окислительном декарбоксилирова-нии пирувата в ацетил-КоА.
Реакции цикла Кребса
Так как при расщеплении одной молекулы глюкозы образуются две молекулы пирувата, то при окислении их до 2 молекул ацетил-КоА и последующих двух оборотов цикла трикарбоновых кислот синтезируется 30 молекул АТФ (следовательно, окисление одной молекулы пирувата до СО2 и Н2O дает 15 молекул АТФ).
К этому надо добавить 2 молекулы АТФ, образующиеся при аэробном гликолизе, и 4 молекулы АТФ, синтезирующихся за счет окисления 2 молекул внемитохондриального НАДН2, которые образуются при окислении 2 молекул глицеральдегид-3-фосфата в дегидрогеназной реакции. Итого получим, что при расщеплении в тканях 1 молекулы глюкозы по уравнению: C6H1206 + 602 -> 6СO2 + 6Н2O синтезируется 36 молекул АТФ, что способствует накоплению в макроэргических фосфатных связях аденозинтрифосфата 36 X 34,5 ~ 1240 кДж (или, по другим данным, 36 Х 38 ~ 1430 кДж) свободной энергии. Другими словами, из всей освобождающейся при аэробном окислении глюкозы свободной энергии (окодо 2840 кДж) до 50% ее аккумулируется в митохондриях в форме, которая может быть использована для выполнения различных физиологических функций. Несомненно, что в энергетическом отношении полное расщепление глюкозы является более эффективным процессом, чем гликолиз. Необходимо отметить, что образовавшиеся в процессе превращения глицеральдегид-3-фосфата 2 молекулы НАДН2 в дальнейшем при окислении дают не 6 молекул АТФ, а только 4. Дело в том, что сами молекулы внемитохондриального НАДН2 не способны проникать через мембрану внутрь митохондрий. Однако отдаваемые ими электроны могут включаться в митохондриальную цепь биологического окисления с помощью так называемого глицерофосфатного челночного механизма (рис. 92). Как видно на рисунке, цитоплазматический НАДН2 сначала реагирует с цитоплазматическим дигидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализируется НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой:
Дигидрооксиацетонфосфат + НАДН2 глицерол-3-фосфат + НАД
Образовавшийся глицерол-3-фосфат легко проникает через митохондриальную мембрану. Внутри митохондрии другая (митохондриальная) глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (флавиновый фермент) снова окисляет глицерол-3-фосфат до дигидроксиацетонфосфата:
Глицерол-З-фосфат + ФАД Дигидроксиацетонфосфат + фАДН2
Восстановленный флавопротеид (фермент — ФАДН2) вводит, на уровне KoQ приобретенные им электроны в цепь биологического окисления и сопряженного с ним окислительного фосфорилирования, а дигидроксиацетонфосфат выходит из митохондрий в цитоплазму и может вновь взаимодействовать с цитоплазматическим НАДН2. Таким образом, пара электронов (из одной молекулы цитоплазматического НАДН2), вводимая в дыхательную цепь с помощью глицерофосфатного челночного механизма, дает не 3 АТФ, а 2 АТФ.
В настоящее время четко установлено, что глицерофосфатный челночный механизм имеет место в клетках печени. Относительно других тканей этот вопрос пока не выяснен.
Цикл Кребса также называется циклом трикарбоновых кислот , так как они образуются в нем в качестве промежуточных продуктов. Представляет собой ферментативный кольцевой конвейер, «работающий» в матриксе митохондрий.
Результатом цикла Кребса является синтез небольшого количества АТФ и образование НАД · H2, который далее направляется на следующий этап клеточного дыхания – дыхательную цепь (окислительное фосфорилирование), расположенную на внутренней мембране митохондрий.
Образовавшаяся в результате гликолиза пировиноградная кислота (пируват) поступает в митохондрии, где она в конечном итоге полностью окисляется, превращаясь в углекислый газ и воду. Сначала это происходит в цикле Кребса, затем при окислительном фосфорилировании.
До цикла Кребса пируват декарбоксилируется и дегидрируется. В результате декарбоксилирования отщепляется молекула CO2, дегидрирование - это отщепление атомов водорода. Они соединяются с НАД.
В результате из пировиноградной кислоты образуется уксусная, которая присоединяется к коферменту А. Получается ацетилкофермент А (ацетил-КоА) – CH3CO~S-КоА, содержащий высокоэнергетическую связь.
Превращение пирувата в ацетил-КоА обеспечивает большой ферментативный комплекс, состоящий из десятков полипептидов, связанным с переносчиками электронов.
Цикл Кребса начинается с гидролиза ацетил-КоА, при котором отщепляется ацетильная группа, содержащая два атома углерода. Далее ацетильная группа включается в цикл трикарбоновых кислот.
Ацетильная группа присоединяется к щавелевоуксусной кислоте, имеющей четыре атома углерода. В результате образуется лимонная кислота, включающая шесть атомов углерода. Энергию для этой реакции поставляет макроэргическая связь ацетил-КоА.
Далее следует цепь реакций, в которых связанная в цикле Кребса ацетильная группа дегидрируются с высвобождением четырех пар атомов водорода и декарбоксилируются с образованием двух молекул CO2. При этом для окисления используется кислород, отщепляемый от двух молекул воды, а не молекулярный . Процесс называется окислительным декарбоксилированием . В конце цикла щавелевоуксусная кислота регенерируется.
Вернемся на этап лимонной кислоты. Ее окисление проходит за ряд ферментативных реакций, при которых образуются изолимонная, щавелевоянтарная и другие кислоты.
В результате этих реакций, на разных стадиях цикла, восстанавливаются три молекулы НАД и одна ФАД, образуется ГТФ (гуанозинтрифосфат), содержащий макроэргическую фосфатную связь, энергия которой впоследствии используется для фосфорилирования АДФ. В результате образуется молекула АТФ.
Лимонная кислота теряет два атома углерода с образованием двух молекул CO2.
В результате ферментативных реакций лимонная кислота превращается в щавелевоуксусную, которая снова может соединиться с ацетил-КоА. Цикл повторяется.
В составе лимонной кислоты присоединившийся остаток ацетил-КоА сгорает с образованием углекислого газа, атомов водорода и электронов. Водород и электроны переносятся на НАД и ФАД, которые являются акцепторами для него.
Окисление одной молекулы ацетил-КоА дает одну молекулу АТФ, четыре атома водорода и две молекулы углекислого газа. То есть углекислый газ, выделяемый при аэробном дыхании, образуется на этапе цикла Кребса . При этом молекулярный кислород (O2) здесь не используется, он необходим лишь на этапе окислительного фосфорилирования.
Атомы водорода присоединяются к НАД или ФАД, в таком виде далее попадают в дыхательную цепь.
Одна молекула глюкозы дает две молекулы пирувата и, следовательно, два ацетил-КоА. Таким образом на одну молекулу глюкозы приходится два оборота цикла трикарбоновых кислот. В общей сложности образуются две молекулы АТФ, четыре CO2, восемь атомов H.
Следует отметить, что не только глюкоза и образующийся из нее пируват поступают в цикл Кребса. В результате расщепления ферментом липазой жиров образуются жирные кислоты, окисление которых также приводит к образованию ацетил-КоА, восстановлению НАД, а также ФАД (флавинадениндинуклеотида).
Если клетка испытывает дефицит углеводов и жиров, то окислению могут подвергаться аминокислоты. При этом образуются ацетил-КоА и органические кислоты, которые далее участвуют в цикле Кребса.
Таким образом неважно, каким был первичный источник энергии. В любом случае образуется ацетил-КоА, представляющий собой универсальное для клетки соединение.
Цикл трикарбоновых кислот (Кребса)
(ЦТК, лимоннокислый цикл, цикл Кребса)
ЦТК, как и реакции митохондриального окисления, протекает в митохондриях. Представляет собой серию реакций, замкнутых в цикл.
Образовавшиеся молекулы ЩУК реагируют с новой молекулой Ацетил-КоА и цикл повторяется вновь от образования цитрата до его превращения в ЩУК.
В реакциях этого цикла участвуют четыре из девяти субстратов МтО.
Происходит серия дегидрогеназных реакций. Из них 3-я, 4-я и 8-я происходят с участием НАД-зависимых дегидрогеназ, и каждая из этих реакций позволяет получить 3 молекулы АТФ. На 6-й стадии происходит ФАД-зависимая дегидрогеназная реакция, которая сопряжена с образованием 2-х молекул АТФ (Р/О = 2).
На 5-й стадии 1 молекула АТФ образуется путем субстратного фосфорилирования.
Итого за 1 оборот ЦТК образуется 12 молекул АТФ.
Смысл ЦТК заключается в том, чтобы остатки уксусной кислоты расщепились с образованием большого количества АТФ. Кроме того, из ацетатных остатков образуется СО2 и Н2О, как конечные продукты обмена веществ.
СО2 образуется в ходе ЦТК дважды:
1. на третьей стадии (окисление изоцитрата)
2. на четвертой стадии (окисление альфа-кетоглутарата).
Если прибавить еще 1 молекулу СО2, которая образуется до начала ЦТК — при превращении ПВК в Ацетил-КоА, то можно говорить о трех молекулах СО2, образующихся при распаде ПВК. Суммарно эти молекулы, образующиеся при распаде ПВК, составляют до 90% углекислоты, которая выводится из организма.
ИТОГОВОЕ УРАВНЕНИЕ ЦТК
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЦТК
ГЛАВНАЯ РОЛЬ ЦТК — ОБРАЗОВАНИЕ БОЛЬШОГО КОЛИЧЕСТВА АТФ.
1. ЦТК — главный источник АТФ. Энергию для образования большого количества АТФ дает полный распад Ацетил-КоА до СО2 и Н2О.
2. ЦТК — это универсальный терминальный этап катаболизма веществ всех классов.
3. ЦТК играет важную роль в процессах анаболизма (промежуточные продукты ЦТК):
— из цитрата → синтез жирных кислот
— из aльфа-кетоглутарата и ЩУК → синтез аминокислот
— из ЩУК → синтез углеводов
— из сукцинил-КоА → синтез гема гемоглобина
АВТОНОМНАЯ САМОРЕГУЛЯЦИЯ ЦТК
В ЦТК два ключевых фермента:
1) цитратсинтаза (1-я реакция)
2) изоцитратдегидрогеназа (3-я реакция)
Оба фермента аллостерически ингибируются избытком АТФ и НАДН2. Изоцитратдегидрогеназа сильно активируется АДФ.
Цикл трикарбоновых кислот
Если АДФ нет, то этот фермент неактивен. В условиях энергетического покоя концентрация АТФ увеличивается, и скорость реакций ЦТК мала — синтез АТФ уменьшается.
Изоцитратдегидрогеназа ингибируется АТФ намного сильнее, чем цитратсинтаза, поэтому в условиях энергетического покоя повышается концентрация цитрата, и он выходит в цитоплазму по градиенту концентраций путем облегченной диффузии. В цитоплазме цитрат превращается в Ацетил-КоА, который участвует в синтезе жирных кислот.
Современные классификации сердечно сосудистой системы
Скорость кровотока, развитие сердца
Тромбоцитопеническая пурпура
Транспорт газов кровью, состав плазмы
Фибринолиз и свёртывание крови
Состав, свойства компонентов плазмы крови
Реакция коагглютинации, компенсации, Кумбса, оседания, пассивной гемагглютинации
Занятие № 12. «Цикл трикарбоновых кислот»
Цель занятия : изучить механизм некоторых реакций цикла Кребса. Освоить метод количественного определения пировиноградной кислоты в моче.
ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:
1. Окислительное декарбоксилирование пирувата как предварительный этап цикла лимонной кислоты. Перечислите витамины и коферменты, задействованные в этом процессе.
2. Реакции цикла лимонной кислоты. Что определяет общее направление реакций в цикле? В какой части клетки протекает этот процесс? Почему?
3. Какие коферменты и витамины участвуют в цикле Кребса? Объясните, как они работают, с указанием конкретных реакций.
4. Расскажите о реакциях цикла Кребса, в результате которых образуются НAДH2 и ФAДН2. Какова дальнейшая судьба этих соединений?
5. Функции цикла трикарбоновых кислот. Объясните, какое значение для цикла лимонной кислоты имеет анаплеротическая реакция?
6. Энергетический выход цикла трикарбоновых кислот. Сколько молекул ATФ образуется в ходе оборота через цикл одной молекулы лимонной кислоты? Все ли молекулы ATФ, образующиеся при полном окислении активного ацетила, синтезируются путем окислительного фосфорилирования. Как регулируется скорость цикла?
Экспериментальная работа.
Одним из методов количественного анализа в биохимии является фотокалориметрия. Метод основан на измерении оптической плотности окрашенных растворов, которые получают при взаимодействии субстрата с различными химическими агентами. Концентрация субстрата пропорциональна степени окрашивания раствора.
Перед началом лабораторных опытов ознакомьтесь с устройством ФЭК и правилами работы на нем.
Опыт 1. Определение концентрации пировиноградной кислоты (ПВК) в моче.
2. Набор пипеток.
3. Фотоколориметр.
4. Кюветы, 0,5 см.
Реактивы. 1. Дистиллированная вода.
3. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.
4. 2,4-динитрофенилгидразин, раствор.
ПВК крови конденсируется с 2,4-динитрофинилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде дает коричнево-красный цвет раствора. По интенсивности его окраски судят о содержании ПВК.
1. В три пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:
2. Содержимое пробирок на 15 мин поместите в темное место при комнатной температуре.
До 10% энергии в клетке образуется из аминокислот
В каждую пробирку внесите по 1 мл 10%-го раствора NаOH и через пять минут измерьте оптическую плотность при длине волны 620 нм опытной пробы против контрольной (О) и калибровочной пробы против контрольной (К).
4. Расчет проведите и по готовому калибровочному графику.
= мг/сутки
Для пересчета содержания ПВК (в мг) в единицы количества вещества (мкмоль) надо умножить соответствующие величины на 11,4 (коэффициент пересчета).
Норма для человека: 10-25 мг/сутки или 114-284 мкмоль/сутки пировиноградной кислоты.
Сравните полученные значения с нормальными величинами. Каковы причины повышенного содержания пировиноградной кислоты в сыворотке крови и моче?
Опыт 2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц.
Приборы. 1. Штатив с пробирками.
2. Набор пипеток.
3. Ступка с пестиком.
4. Водяная баня.
Реактивы. 1. Мышечная ткань курицы или кролика.
2. Янтарная кислота, 5%-ный раствор.
3. Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор.
4. Растительное масло.
5. Стеклянный песок.
1. Взвесьте 10 г мышечной ткани и разотрите в ступке со стеклянным песком.
2. Полученный гомогенат промойте несколько раз на марле физраствором, для удаления растворимых веществ.
3. Полученную смесь разлейте по 5 мл в три пронумерованные пробирки.
4. Первую пробирку погрузите на 5 минут в кипящую водяную баню, после чего охладите ее до комнатной температуры.
5. В пробирку №1 и №2 добавьте 3 мл 5%-ной янтарной кислоты и 3 капли раствора метиленового синего (до появления голубого окрашивания).
6. В пробирку №3 добавьте 0,5 мл дистиллированной воды и 3 капли раствора метиленового синего (до появления голубого окрашивания).
7. Затем во все пробирки налейте немного масла для изоляции смеси от кислорода воздуха.
8. Все пробирки инкубируйте в водяной бане (40оС) в течение 10 минут.
Дайте объяснение наблюдаемым явлениям. Какова функция метиленовой сини в данном эксперименте? На какое соединение эта функция возлагается в живой клетке?
Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________
Предыдущая123456789101112Следующая
- Общее представление. Характеристика этапов ЦТК.
- Конечные продукты ЦТК.
- Биологическая роль ЦТК.
- Регуляция ЦТК.
- Нарушения работы ЦТК.
· ОБЩЕЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭТАПОВ ЦТК
Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) представляет собой магистральный, циклический, метаболический путь , в котором происходит окисление активной уксусной кислоты и некоторых других соединений, образующихся при распаде углеводов, липидов, белков и который обеспечивает дыхательную цепь восстановленными коферментами.
ЦТК был открыт в 1937 году Г. Кребсом . Он обобщил имевшиеся к тому времени экспериментальные исследования и построил полную схему процесса.
Реакции ЦТК протекают в митохондриях в аэробных условиях .
В начале цикла (рис. 6) происходит конденсация активной уксусной кислоты (ацетил-КоА) со щавелево-уксусной кислотой (оксалоацетатом) с образованием лимонной кислоты (цитрата) . Эта реакция катализируется цитратсинтазой .
Далее цитрат изомеризуется в изоцитрат . Изомеризация цитрата осуществляется путем дегидратации с образованием цис-аконитата и его последующей гидратацией. Катализ обеих реакций обеспечивает аконитаза .
На 4-й стадии цикла происходит окислительное декарбоксилирование изоцитрата под действием изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ) с образованием a-кетоглутаровой кислоты , НАДН(Н +) или НАДФН(Н +) и СО 2. НАД-зависимая ИДГ локализована в митохондриях, а НАДФ-зависимый фермент присутствует в митохондриях и цитоплазме.
В ходе 5-й стадии осуществляется окислительное декарбоксилирование a-кетоглутарата с образованием активной янтарной кислоты (сукцинил-КоА) , НАДН(Н) и СО 2 . Этот процесс катализирует a-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс , состоящий из трех ферментов и пяти коферментов. Ферменты: 1) a-кетоглутаратдегидрогеназа, связанная с коферментом ТПФ; 2) транссукцинилаза, коферментом которой является липоевая кислота;
3) дигидролипоилдегидрогеназа, связанная с ФАД. В работе a-кетоглутаратдегидрогеназ-
ного комплекса принимают участие также коферменты КоА-SH и НАД.
На 6-й стадии происходит расщепление макроэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА, сопряженное с фосфорилированием ГДФ. Образуются янтарная кислота (сукцинат) и ГТФ (на уровне субстратного фосфорилирования) . Реакция катализируется сукцинил-КоА-синтетазой (сукцинилтиокиназой) . Фосфорильная группа ГТФ может переноситься на АДФ: ГТФ +АДФ ® ГДФ + АТФ . Катализ реакции происходит при участии фермента нуклеозиддифосфокиназы.
В ходе 7-й стадии осуществляется окисление сукцината под действием сукцинатдегидрогеназы с образованием фумарата и ФАДН 2 .
На 8-й стадии фумаратгидратаза обеспечивает присоединение воды к фумаровой кислоте с образованием L - яблочной кислоты (L- малата) .
L-малат на 9-й стадии под действием малатдегидрогеназы окисляется до оксалоацетата , в реакции также образуется НАДН(Н +). На оксалоацетате метаболический путь замыкается и снова повторяется , приобретая циклический характер.
Рис. 6. Схема реакций цикла трикарбоновых кислот.
· КОНЕЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ЦТК
Суммарное уравнение ЦТК имеет следующий вид:
// О
СН 3 – С~ S-КоА + 3 НАД + + ФАД + АДФ + Н 3 РО 4 + 3 Н 2 О ®
® 2 СО 2 + 3 НАДН(Н +) + ФАДН 2 + АТФ + КоА-SH
Таким образом конечными продуктами цикла (в расчете на 1 оборот) являются восстановленные коферменты - 3 НАДН(Н +) и 1 ФАДН 2 , 2 молекулы углекислого газа, 1 молекула АТФ и 1 молекула КоА- SH.
· БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЦТК
Цикл Кребса выполняет интеграционную, амфиболическую (т.е. катаболическую и анаболическую ), энергетическую и водороддонорную роль.
Интеграционная роль состоит в том, что ЦТК представляет собой конечный общий путь окисления топливных молекул – углеводов, жирных кислот и аминокислот.
В ЦТК происходит окисление ацетил-КоА – это катаболическая роль .
Анаболическая роль цикла заключается в том, что он поставляет промежуточные продукты для биосинтетических процессов. Например, оксалоацетат используется для синтеза аспартата, a-кетоглутарат – для образования глутамата , сукцинил-КоА – для синтеза гема .
Одна молекула АТФ образуется в ЦТК на уровне субстратного фосфорилирования – это энергетическая роль.
Водороддонорная рольсостоит в том, что ЦТК обеспечивает восстановленными коферментами НАДН(Н +) и ФАДН 2 дыхательную цепь, в которой происходит окисление водорода этих коферментов до воды, сопряженное с синтезом АТФ. При окислении одной молекулы ацетил-КоА в ЦТК образуются 3 НАДН(Н +) и 1 ФАДН 2
Выход АТФ при окислении ацетил-КоА составляет 12 молекул АТФ (1 АТФ в ЦТК на уровне субстратного фосфорилирования и 11 молекул АТФ при окислении 3 молекул НАДН(Н +) и 1 молекулы ФАДН 2 в дыхательной цепи на уровне окислительного фосфорилирования).
· РЕГУЛЯЦИЯ ЦТК
Скорость функционирования ЦТК точно подогнана к потребности клеток в АТФ, т.е. цикл Кребса сопряжен с дыхательной цепью, функционирующей только в аэробных условиях. Важной регуляторной реакцией цикла является синтез цитрата из ацетил-КоА и оксалоацетата, протекающий при участии цитратсинтазы . Высокий уровень АТФ ингибирует данный фермент. Вторая регуляторная реакция цикла – изоцитратдегидрогеназная . АДФ и НАД + активируют фермент, НАДН(Н +) и АТФ ингибируют . Третьей регуляторной реакцией является окислительное декарбоксилирование a-кетоглутарата . НАДН(Н +),сукцинил-КоА и АТФ ингибируют a-кетоглутаратдегидрогеназу.
· НАРУШЕНИЯ РАБОТЫ ЦТК
Нарушение функционирования ЦТК может быть связано:
С недостатком ацетил-КоА;
С недостатком оксалоацетата (он образуется при карбоксилировании пирувата, а последний в свою очередь при распаде углеводов). Несбалансированность рациона по углеводам влечет за собой включение ацетил-КоА в кетогенез (образование кетоновых тел), что приводит к кетозам;
С нарушением активности ферментов по пичине недостатка витаминов, входящих в состав соответствующих коферментов (недостаток витамина В 1 приводит к недостатку ТПФ и нарушению функционирования a-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса; недостаток витамина В 2 ведет к недостатку ФАД и нарушению активности сукцинатдегидрогеназы; недостаток витамина В 3 влечет за собой недостаток кофермента ацилирования КоА-SH и нарушение активности a-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса; недостаток витамина В 5 приводит к недостатку НАД и нарушению активности изоцитратдегидрогеназы, a-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса и малатдегидрогеназы; недостаток липоевой кислоты также приводит к нарушению функционирования a-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса);
С недостатком кислорода (нарушен синтез гемоглобина и функционирование дыхательной цепи, а накапливающийся НАДН(Н +) выступает в этом случае в роли аллостерического ингибитора изоцитратдегидрогеназы и a-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса)
· кОнТрольные вопросы
цикл Кребса – представляет собой замкнутую систему биохимических окислительно-восстановительных реакций. Цикл назван по имени английского биохимика Ханса Кребса, который постулировал и экспериментально подтвердил основные реакции аэробного окисления. За проведенные исследования Кребс получил Нобелевскую премию (1953). Цикл имеет еще два названия:
цикл трикарбоновых кислот, так как он включает реакции превращения трикарбоновых кислот (кислот, содержащих три карбоксильные группы);
Цикл лимонной кислоты, так как первой реакцией цикла является образование лимонной кислоты.
Цикл Кребса включает 10 реакций, четыре из которых окислительно-восстановительные. В ходе реакций освобождается 70% энергии.
Чрезвычайно велика биологическая роль этого цикла, поскольку это общий конечный пункт окислительного распада всех основных пищевых продуктов. Это главный механизм окисления в клетке, образно его называют метаболическим «котлом». В процессе окисления топливных молекул (углеводов, аминокислот, жирных кислот происходит обеспечение организма энергией в виде АТФ. Топливные молекулы вступают в цикл Кребса после превращения в ацетил-Ко-А.
Кроме того, цикл трикарбоновых кислот поставляет промежуточные продукты для процессов биосинтеза. Этот цикл происходит в матриксе митохондрий. Рассмотрим реакции цикла Кребса
Цикл начинается с конденсации четырехуглеродного компонента оксалоацетата и двухуглеродного компонента ацетил-Ко-А. Реакция катализируется цитратсинтазой и представляет собой альдольную конденсацию с последующим гидролизом. Промежуточным продуктом является цитрил-Ко-А, который гидролизуется на цитрат и КоА:
IV. Это первая окислительно-восстановительная реакция.
Реакции 4 и 5 представляют собой окислительное декарбоксилирование, катализируются изоцитратдегидрогеназой, промежуточным продуктом реакций является оксалосукцинат.
В сукциниле имеется связь, богатая энергией. Расщепление тиоэфирной связи сукцинил-КоА сопряжено с фосфорилированием гуанозиндифосфата (ГДФ):
Сукцинил-КоА + ~ Ф +ГДФ Сукцинат + ГТФ +КоА
Фосфорильная группа ГТФ легко переносится на АДФ с образованием АТФ:
ГТФ + АДФ АТФ + ГДФ
Это единственная реакция цикла, являющаяся реакцией субстратного фосфорилирования.
VIII. Это третья окислительно-восстановительная реакция:
X. Четвертая окислительно-восстановительная реакция:
В цикле Кребса образуются углекислый газ, протоны, электроны. Четыре реакции цикла являются окислительно-восстановительными, катализируются ферментами – дегидрогеназами, содержащими коферменты НАД, ФАД. Коферменты захватывают образующиеся Н + и ē и передают их в дыхательную цепь (цепь биологического окисления). Элементы дыхательной цепи находятся на внутренней мембране митохондрий.
