Центрифугирование - это разделение механических смесей на составные части действием центробежной силы. Приборы, применяемые для этой цели, называют центрифугами. Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по величине центробежные силы, под действием которых происходит разделение механических смесей, например осаждение взвешенных в жидкости частиц.
Центрифуги: 1 - ручная: 2 - с электроприводом.
В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделения от плазмы крови, от , плотных частиц от жидкой части мочи и т. д. Для этой цели применяют или ручные центрифуги (рис., 1), или центрифуги с электроприводом, скорость вращения которых можно регулировать (рис., 2).
Ультрацентрифуги, скорость вращения роторов которых превышает 40 000 об/мин, применяют обычно в экспериментальной практике для разделения органелл клеток, отделения коллоидных частиц, макромолекул и т. д.
Центрифугирование - это разделение грубодисперсных систем, состоящих из жидких и твердых компонентов с разными плотностями, при помощи специальных аппаратов, называемых центрифугами. Принцип действия центрифуги основан на создании большой центробежной силы, под влиянием которой скорость разделения компонентов смеси, помещенной в центрифугу, увеличивается во много раз по сравнению со скоростью разделения их под действием силы тяжести.
Метод центрифугирования широко применяется в биологии, медицине и технике, нередко заменяя процессы фильтрования, отстаивания и отжимания.
Центрифуга имеет корпус, механизм привода, ротор, рабочую (ограждающую) камеру и панель управления. Некоторые центрифуги снабжены электрочасами, обеспечивающими автоматическое выключение и торможение в диапазоне от 5 до 60 мин. Специальные центрифуги имеют холодильные и вакуумные установки с приборами слежения и автоматического управления. Основная часть любой центрифуги - ротор (в лабораторных центрифугах он обычно располагается на вертикально установленном валу электродвигателя или вращается посредством различных передач от вала двигателя, иногда даже вручную). Ротор центрифуги представляет собой диск (крестовину) с шарнирно закрепленными гнездами для металлических гильз, в которых помещаются пробирки, принимающие при вращении горизонтальное положение.
Иногда ротор делают в виде сплошного металлического усеченного конуса с ячейками для пробирок (угловой ротор); пробирки в нем располагаются под постоянным углом к оси вращения (обычно в 40°). При наклонном положении пробирок происходит расслоение компонентов смеси более быстро. Разделение смеси ведется в пробирках самой разнообразной формы и объема (рис. 1). При работе на больших скоростях используют пробирки из полиэтилена, так как стеклянные лопаются. Расположенные в роторе одна против другой пробирки с обрабатываемым материалом должны быть уравновешены. Этим осуществляется равномерная нагрузка на вал ротора и обеспечивается равномерное вращение вала центрифуги. Для уравновешивания пробирок применяют особые весы (рис. 2).
Рис. 1. Пробирки для центрифугирования.
Рис. 2. Центрифужные весы.
Центрифуги, применяемые в промышленности, отличаются от лабораторных более сложным устройством ротора, позволяющим центрифугировать большое количество материала одновременно или же вести процессы разделения непрерывно.
Центрифуги с небольшой скоростью вращения ротора употребляются в медицине для отделения осадков мочи, сыворотки крови от сгустков, осаждения эритроцитов, при серологических исследованиях и т. д.
Микроцентрифуга (рис. 4) приводится в действие вручную; оборудована двумя сменными насадками, одна из которых имеет гнезда для микропробирок и применяется при определении совместимости крови; другая - с гнездом для вкладывания градуированной микропипетки (гематокрит) - предназначается для определения процентного содержания форменных элементов крови.
Рис. 3. Ручная центрифуга.
Рис. 4. Микроцентрифуга.
Ручная центрифуга (рис. 3) имеет четыре металлические или пластмассовые гильзы для пробирок по 15 мл.
Лабораторная клиническая центрифуга ЦЛК-1 (рис. 5, 7)имеет три скорости вращения (1000, 1500, 3000 об/мин). Ротор-крестовина приспособлен для 12 обычных центрифужных пробирок. Наибольший объем центрифугируемой жидкости - 150 мл.
Центрифуги с большой скоростью вращения ротора в большинстве случаев снабжены сменными роторами, рассчитанными на различные объемы жидкости, и применяются для разделения тонкодисперсных взвесей.
Лабораторная настольная центрифуга ЦЛН-2 (рис. 5, 2) имеет угловой ротор на шесть коротких пробирок общей емкостью 72 мл. Максимальная скорость вращения -9000 об/мин.
Рис. 5. Различные лабораторные центрифуги: 1 - клиническая; 2 - настольная; 3 - угловая малогабаритная; 4 - стационарная; 5 - рефрижераторная.
Угловая малогабаритная центрифуга ЦУМ-1 (рис. 5, 3) имеет три сменных угловых ротора с различным количеством пробирок и гематокрит: ротор для 6 пробирок общей емкостью 150 мл, ротор для 10 пробирок общей емкостью 120 мл, ротор для 24 пробирок общей емкостью 120 мл, гематокрит для двух капилляров. Максимальная скорость вращения- 10 000 об/мин.
Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом.
Лабораторная стационарная центрифуга ЦЛС-2 (рис. 5, 4) имеет два сменных ротора. Ротор-крестовина снабжен четырьмя стальными гильзами емкостью по 500 мл и четырьмя стеклянными пробирками к ним емкостью по 250 мл. Угловой ротор снабжен 8 полиэтиленовыми и стальными пробирками емкостью 50-75 мл. Максимальное вращение роторов до 6000 об/мин. Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом.
К числу специальных центрифуг относится лабораторная рефрижераторная центрифуга ЦЛР-1 (рис. 5,5), предназначаемая для центрифугирования при пониженных температурах (-5° и выше) различных изменяющихся даже при комнатной температуре веществ - большей частью белковых суспензий. Центрифуга имеет три сменных ротора, обеспечивающих различные режимы центрифугирования. Два ротора идентичны но техническим характеристикам роторам центрифуги типа ЦЛС-2, третий ротор, надевающийся на добавочную ось, развивает 18 000-18 500 об/мин. Максимальный объем исследуемого препарата -48 мл. Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом. Охлаждение рабочей камеры осуществляется при помощи холодильной машины.
См. также Ультрацентрифугирование.
Центрифугирование
способ разделения неоднородных, дисперсных жидких систем в поле центробежных сил (центрифугатном поле). Обладает более высокой способностью к разделению, чем отжимание, отстаивание и фильтрование. Ц. осуществляют в центрифугах, принцип работы к-рых основан на создании центробежной силы, увеличивающей скорость разделения компонентов смеси по сравнению со скоростью их разделения только под влиянием силы тяжести. Эффективность центрифуги оценивают по «фактору разделения» К, к-рый рассчитывают по формуле: К= (2p n) 2 r/g, где n -число оборотов в мин; r-радиус вращения ротора;g - ускорение свободного падения. В практике чаще с этой целью применяют g, к-рое может быть найдено из вышеприведенной формулы или по формуле g=l,117 x l0 -5 N 2 r, где N-число оборотов; г- радиус. Центрифуги состоят из корпуса, двигателя, ротора, механизма передачи, рабочей камеры и панели управления. Гнезда для пробирок или стаканов для более быстрого разделения компонентов смеси располагают под углом (в угловых роторах) или они принимают такое положение при вращении горизонтального ротора. Различия в скоростях седиментации частиц смеси увеличиваются при увеличении плотности среды, в к-рой происходит разделение. В связи с этим иногда Ц. проводят в плотной среде, напр., в р-ре сахарозы. В микробиологии Ц. используют для осаждения микробов, освобождения микробной взвеси от грубых примесей, увеличения плотности микробов в ед. объема и для др. целей. В зависимости от массы микробов применяют различные типы центрифуг. В вирусологии и иммунологии обычно нужны центрифуги с высоким фактором разделения, т. н. супер- и ультрацентрифуги. Для осаждения бактерий лучше использовать центрифуги с фактором разделения около 7 тыс. (9-10 тыс. об/мин). Осаждение грибов, простейших, животных клеток, грубых примесей проводят на центрифугах с малым фактором разделения (1,5 -3 тыс. об/мин). При малых концентрациях процесс оседания частиц затягивается. Его можно ускорить добавлением коагулянта или, напр., убитых бактерий этого же вида. Процесс Ц. начинают с уравновешивания на специальных весах стаканов с содержащими жидкость пробирками, располагающимися в роторе друг против друга. На дно стаканов следует поместить резиновые прокладки. Перед Ц. крышку центрифуги плотно закрывают, включают двигатель, скорость оборотов ротора постепенно увеличивают, доводя до заданной. По истечении времени Ц. двигатель выключают, крышку открывают после полной остановки ротора. При Ц. живых микробов необходимо строго соблюдать правила асептики и техники безопасности. Ц. взвесей, содержащих микробы, лучше проводить в стеклянных или др. надежно стерилизующихся пробирках. Ватную пробку следует обогнуть вокруг края пробирки или стакана и прижать резиновым кольцом. Использование металлических колпачков допустимо только при малых скоростях вращения. Пробирки не следует наполнять более чем на 1 см. от края. Применять для Ц. обычные пробирки или бутылки нельзя. См. улътрацентрифуга.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
- - Рис. 1. Центрифуги. Рис. 1. Центрифуги:1 лабораторная настольная ЦЛН-2;2 лабораторная рефрижераторная ЦЛР-1...
Ветеринарный энциклопедический словарь
- - разделение в поле центробежных сил жидких дисперсных систем с частицами размером более 100 нм. Используют для выделения составляющих фаз из двухкомпонентных и трехкомпонентных систем. Методы и аппаратура...
Химическая энциклопедия
- - разделение неоднородных систем с помощью центробежных сил; применяется для разделения суспензий, осветления загрязнённых жидкостей, классификации шламов по крупности твёрдых частиц и т.д....
Термины атомной энергетики
- - density gradient centrifugation - ...
- - sucrose equilibrium density gradient centrifugation - .Метод разделения макромолекул на основании их коэффициента седиментации
: разделяемая смесь наносится на поверхность раствора с градиентом концентрации сахарозы <... Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь
- - cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation - .Mетод центрифугирования в градиенте плотности
Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь - - разделение неоднородных смесей на составные части различной плотности с помощью центрифуги...
Большой медицинский словарь
- - способ бетонирования в стальных формах отдельных железобетонных изделий с использованием эффекта центробежной силы, создаваемой центрифугой при большой частоте вращения...
Препаративное центрифугирование – один из методов выделения биологического материала для последующего проведения биохимических исследований. Позволяет выделить значительное количество клеточных частиц для комплексного изучения их биологической активности, структуры и морфологии. Также метод применим для выделения основных биологических макромолекул. Сфера использования: медицинские, химические и биохимические исследования.
Классификация методов препаративного центрифугирования
Препаративное центрифугирование осуществляется по одной из следующих методик:
|
- Изопикническое. Может проводиться в градиенте плотности либо обычным путем. В первом случае обрабатываемый материал наслаивается на поверхность буферного раствора с непрерывным градиентом плотности и центрифугируется до разделения частиц по зонам. Во втором случае исследуемая среда центрифугируется до образования осадка из частиц с большим молекулярным весом, после чего из полученного остатка выделяются исследуемые частицы.
- Равновесное. Проводится в градиенте плотности из солей тяжелых металлов. Центрифугирование позволяет установить равновесное распределение концентрации растворенного исследуемого вещества. Затем под воздействием сил центробежного ускорения частицы среды собираются в отдельной зоне пробирки.
Оптимальная методика подбирается с учетом поставленных целей и особенностей исследуемой среды.
Классификация препаративных лабораторных центрифуг
В зависимости от особенностей конструкции и эксплуатационных характеристик препаративные центрифуги можно разделить на 3 основные группы:
 |
|
- Скоростные. Максимальная скорость – 25.000 об/мин при относительном центробежном ускорении до 89.000 g. Для предотвращения нагревания из-за возникающих при вращении ротора сил трения рабочая камера оснащается системой охлаждения. Комплектуются угловыми роторами либо роторами с подвесными контейнерами для размещения биологического материала. Емкость скоростных препаративных
центрифуг – 1.5 дм 3 . - Ультрацентрифуги. Максимальная скорость – 75.000 об/мин при относительном центробежном ускорении до 510.000g. Для предотвращения нагревания из-за возникающих при вращении ротора сил трения оснащаются системой охлаждения и вакуумной установкой. Роторы ультрацентрифуг изготавливается из сверхпрочных титановых либо алюминиевых сплавов. Для уменьшения вибраций из-за неравномерного заполнения ротора имеют гибкий вал.
К отдельной категории следует отнести препаративные центрифуги специального исполнения, предназначенные для проведения определенных разновидностей исследований и решения специфических задач. В эту группу входят центрифуги с нагревательной рубашкой, рефрижераторные центрифуги и другое подобное оборудование.
Особенности конструкции ротора в препаративных центрифугах
Препаративные центрифуги комплектуются угловыми либо горизонтальными роторами:
 |
|
Тип ротора определяет сферу использования оборудования. Возможность смены ротора позволяет использовать одну и ту же модель центрифуги для решения разноплановых задач. Медицинские центрифуги для лаборатории Centurion выпускаются в напольных либо настольных вариантах исполнения, что делает возможным использование оборудования в любых помещениях вне зависимости от доступной площади.
2.5.1 Природа градиентов
Для создания градиентов плотности растворов чаще всего применяются растворы сахарозы, иногда с фиксированным рН. В некоторых случаях хорошее разделение получается при использовании вместо обычной воды D 2 0. В табл. 2.1 приведены свойства некоторых растворов сахарозы.
Выбор градиента диктуется конкретными задачами фракционирования. Так, например, фикол, выпускаемый фирмой Pharmacia Fine Chemicals, может заменять сахарозу в тех случаях, когда необходимо создать градиенты с большой плотностью и низким осмотическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана»
2.5.2 Методика создания ступенчатого градиента плотности
Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку.
2.5.3 Методика создания плавного градиента плотности
В большинстве случаев для создания плавного градиента плотности пользуются специальным устройством. Оно состоит из двух цилиндрических сосудов строго определенного одинакового диаметра, сообщающихся друг с другом в нижней части с помощью стеклянной трубки с контрольным клапаном, что позволяет регулировать пропорции, в которых смешивается содержимое обоих сосудов. Один из них снабжен мешалкой и имеет выходное отверстие, через которое раствор стекает в центрифужные пробирки. Более плотный раствор помещают в смеситель; второй цилиндр заполняют раствором меньшей плотности. Высота столбика растворов в обоих цилиндрах устанавливается таким образом, чтобы гидростатическое давление в них было одинаковым. Более плотный раствор постепенно выпускается из смесителя в центрифужные пробирки и одновременно замещается равным объемом раствора меньшей плотности, поступающего в смеситель из второго цилиндра через контрольный клапан. Гомогенность раствора в смесителе обеспечивается за счет постоянного перемешивания раствора с помощью мешалки. По мере сливания раствора в центрифужные пробирки плотность его уменьшается и в пробирках создается линейный градиент плотности. Нелинейные градиенты можно создавать при помощи системы, состоящей из двух цилиндров неодинакового диаметра.
Для формирования градиентов плотности различной крутизны пользуются системой из двух механически управляемых шприцов, которые заполняют растворами неодинаковой плотности. Различные градиенты можно создавать, изменяя относительную скорость движения поршней.
2.5.4 Извлечение градиентов из центрифужных пробирок
После завершения центрифугирования и разделения частиц необходимо извлечь образовавшиеся зоны. Это делают несколькими способами, чаще всего методом вытеснения. Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60-70%-ный раствор сахарозы. Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций. Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллюлозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой. При подходящей конструкции режущего устройства потеря раствора будет минимальной. Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.
2.5.5 Препаративные центрифуги и их применение
Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги. Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об мин -1 и ОЦУ до 6000 g . Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Одной из особенностей этого вида центрифуг является их большая емкость - от 4 до 6 дм 3 , что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10,50 и 100 см 3 , но и сосудами емкостью до 1,25 дм 3 . Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.
Скоростные центрифуги дают предельную скорость 25 000 об-мин -1 и ОЦУ до 89000g. Камера ротора снабжена системой охлаждения, предотвращающей нагревание, которое возникает вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм 3 и снабжены сменными роторами, как угловыми, так и с подвесными стаканами.
Препаративные ультрацентрифуги дают предельную скорость до 75000 об-мин -1 и максимальное центробежное ускорение 510 000 g . Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев ротора вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых или титановых сплавов. В основном применяют роторы из алюминиевых сплавов, однако в тех случаях, когда необходимы особенно высокие скорости, пользуются роторами из титана. Для уменьшения вибрации, возникающей в результате нарушения равновесия ротора из-за неравномерного наполнения центрифужных пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Центрифужные пробирки и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1 г. Аналогичные требования следует соблюдать и при загрузке роторов центрифуг общего назначения.
2.6 Конструкция роторов
2.6.1 Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами
Роторы препаративных центрифуг обычно бывают двух типов - угловые и с подвесными стаканами. Угловыми они называются потому, что помещаемые в них центрифужные пробирки все время находятся под определенным углом к оси вращения. В роторах с подвесными стаканами пробирки устанавливаются вертикально, а при вращении под действием возникающей центробежной силы переходят в горизонтальное положение; угол наклона к оси вращения составляет 90°.
В угловых роторах расстояние, проходимое частицами до соответствующей стенки пробирки, весьма невелико, и поэтому седиментация происходит сравнительно быстро. После столкновения со стенками пробирки частицы соскальзывают вниз и образуют на дне осадок. При центрифугировании возникают конвекционные потоки, которые в значительной степени затрудняют разделение частиц с близкими седиментационными свойствами. Тем не менее роторы подобной конструкции с успехом применяются для разделения частиц, скорости седиментации которых различаются довольно сильно.
В роторах с подвесными стаканами также наблюдаются конвекционные явления, однако выражены они не так сильно. Конвекция является результатом того, что под действием центробежного ускорения частицы оседают в направлении, не строго перпендикулярном оси вращения, и поэтому, как и в угловых роторах, ударяются о стенки пробирки и соскальзывают на дно.
Конвекционных явлений и эффектов завихрения удается до некоторой степени избежать, используя пробирки секториальной формы в роторах с подвесными стаканами и регулируя скорость вращения ротора; перечисленных выше, недостатков лишен также метод центрифугирования в градиенте плотности.
2.6.2 Роторы непрерывного действия
Роторы непрерывного действия предназначены для скоростного фракционирования относительно небольших количеств твердого материала из суспензий больших объемов, например для выделения клеток из питательных сред. В ходе центрифугирования суспензия частиц добавляется в ротор непрерывно; пропускная способность ротора зависит от природы осаждаемого препарата и варьируете пределах от 100 см 3 до 1 дм 3 в 1 мин. Особенность ротора состоит в том, что он представляет собой изолированную камеру специальной конструкции; содержимое ее не сообщается с внешней средой, а поэтому не загрязняется и не распыляется.
2.6.3 Зональные роторы, или роторы Андерсона
Зональные роторы делают из алюминиевых или титановых сплавов, которые способны выдерживать весьма значительные центробежные ускорения. Обычно в них имеется цилиндрическая полость, закрывающаяся съемной крышкой. Внутри полости, на оси вращения расположена осевая трубка, на которую надевается насадка с лопастями, разделяющими полость ротора на четыре сектора. Лопасти или перегородки имеют радиальные каналы, по которым из осевой трубки к периферии ротора нагнетается градиент. Благодаря такой конструкции лопастей конвекция сведена до минимума.
Заполнение ротора производится при его вращении со скоростью около 3000 об/мин -1 . В ротор нагнетают заранее созданный градиент, начиная со слоя наименьшей плотности, который равномерно распределяется по периферии ротора и удерживается у внешней его стенки перпендикулярно оси вращения благодаря центробежной силе. При последующем добавлении слоев градиента большей плотности происходит непрерывное смещение к центру менее плотных слоев. После того как в ротор будет нагнетен весь градиент, его заполняют до полного объема раствором, называемым «подушкой», плотность которого совпадает или несколько превышает наибольшую плотность преформированного градиента.
Затем через осевую трубку, наслаивают исследуемый образец, который вытесняют из трубки в объем ротора с помощью раствора меньшей плотности, при этом с периферии удаляется такой же объем «подушки». После всех этих процедур скорость вращения ротора доводят до рабочей и в течение необходимого промежутка времени проводят либо зонально-скоростное, либо зонально-изопикническое фракционирование. Извлечение фракций проводят при скорости вращения ротора 3000 об - мин -1 . Содержимое ротора вытесняют путем добавления с периферии «подушки», в первую очередь вытесняются менее плотные слои. Благодаря особой конструкции осевого канала ротора Андерсона смешивания зон при их вытеснении не происходит. Выходящий градиент пропускают через регистрирующее устройство, например ячейку спектрофотометра, с помощью которого по поглощению при 280 нм можно определить содержание белка, или через специальный детектор радиоактивности, после чего собирают фракции.
Емкость зональных роторов, используемых при средних скоростях, варьирует от 650 до 1600 см 3 , что позволяет получать довольно большое количество материала. Зональные роторы применяются для удаления белковых примесей из различных препаратов и для выделения и очистки митохондрий, лизосом, полисом и белков.
2.6.4 Анализ субклеточных фракций
Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства.
Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки. Если бы это положение было верно, то ферменты могли бы выступать в роли маркеров для соответствующих органелл: например, цито-хромоксидаза и моноаминооксидаза служили бы ферментами-маркерами митохондрий, кислые гидролазы - маркерами лизосом, каталаза - маркером пероксисом, а глюкозо-6-фосфатаза - маркером мембран микросом. Оказалось, однако, что некоторые ферменты, например малатдегидрогеназа, Р -глюкуронидаза, НАДФ" Н-цитохром-с-редуктаза, локализованы более чем в одной фракции. Поэтому к выбору ферментов-маркеров субклеточных фракций в каждом конкретном случае следует подходить с большой осторожностью. Более того, отсутствие фермента-маркера еще не означает отсутствия соответствующих органелл. Вполне вероятно, что при фракционировании происходит потеря фермента органеллами или он ингибируется или инактивируется; поэтому для каждой фракции обычно определяют не менее двух ферментов-маркеров.
|
Фракция |
Объем, см" |
Общее разведение |
Экснюк-ция, 660 нм |
Единицы активности фермента |
Выход активности во фракции, % |
2.7 Фракционирование методом дифференциального центрифугирования
2.7.1 Оформление результатов
Результаты, полученные при фракционировании тканей, удобнее всего оформлять в виде графиков. Так, при исследовании распределения ферментов в тканях данные лучше всего представлять в виде гистограмм, дающих возможность визуально оценить результаты проведенных экспериментов.
Ферментативную активности содержание белка в пробе определяют как в исходном гомогенате, так и в каждой выделенной субклеточной фракции в отдельности. Суммарная ферментативная активность и содержание белка во фракциях не должны сильно отличаться от соответствующих значений в исходном гомогенате.
Затем проводят расчет ферментативной активности и содержания белка в каждой фракции в % от общего выхода, на основании чего составляют гистограмму. По оси абсцисс последовательно откладывают относительное количество_ белка в каждой фракции в порядке их выделения, а по оси ординат - относительную удельную активность каждой фракции. Таким образом, по площади столбиков определяют ферментативную активность каждой фракции.
2.7.2 Аналитическое ультрацентрифугирование
В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70 000 об-мин -1 , создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g . Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Вращается ротор в вакуумной камере, снабженной холодильным устройством, и имеет две ячейки, аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально, параллельно оси вращения. Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются также два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения, с помощью которых определяют соответствующие расстояния в аналитической ячейке. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см 3 , имеет секториальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая почти идеальные условия седиментации. На торцах аналитической ячейки имеются окошки с кварцевыми стеклами. Аналитические ультрацентрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в ультрафиолете, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления - с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея. Два последних метода основаны на том, что при прохождении света через прозрачный раствор, состоящий из зон с различной плотностью, на границе зон происходит преломление света. При седиментации между зонами с тяжелыми и легкими частицами образуется граница, которая действует как преломляющая линза; при этом на фотопластинке, использующейся в качестве детектора, появляется пик. В ходе седиментации происходит перемещение границы, а следовательно, и пика, по скорости передвижения которого можно судить о скорости седиментации материала. Интерферометрические системы отличаются большей чувствительностью, чем шлирен-системы. Аналитические ячейки бывают односекторные, которые применяются наиболее часто, и двухсекторные, которые используются для сравнительного изучения растворителя и растворенного вещества.
В биологии аналитическое ультрацентрифугирование применяется для определения молекулярных весов макромолекул, проверки чистоты получаемых образцов, а также для исследования конформационных изменений в макромолекулах.
2.8 Применение аналитического ультрацентрифугирования
2.8.1 Определение молекулярных весов
Существует три основных метода определения молекулярных весов при помощи аналитического ультрацентрифугирования: определение скорости седиментации, метод седиментациоиного равновесия и метод приближения к седиментационному равновесию.
Определение молекулярного веса по скорости седиментации - это наиболее распространенный метод. Центрифугирование проводят при больших скоростях, так что частицы, вначале равномерно распределенные по всему объему, начинают упорядочение перемещаться по радиусу от центра вращения. Между областью растворителя, уже свободной от частиц, и той его частью, которая их содержит, образуется четкая граница раздела. Эта граница при центрифугировании перемещается, что дает возможность определять скорость седиментации частиц при помощи одного из вышеупомянутых методов, регистрируя это перемещение на фотопластинке.
Скорость седиментации определяется следующим соотношением:
где х - расстояние от оси вращения в см,
t - время в с,
w - угловая скорость в рад-с -1 ,
s - коэффициент седиментации "молекулы.
Коэффициент седиментации - это скорость, отнесенная к единице ускорения, его измеряют в единицах Сеедберга ; 1 единица Сведберга равна 10 _13 с. Численное значение s зависит от молекулярного веса и формы частиц и является величиной, характерной для данной молекулы или надмолекулярной структуры. Например, коэффициент седиментации лизоцима равен 2,15 S; катал аза имеет коэффициент седиментации 11.35S, субъединицы рибосом бактерий - от 30 до 50S, а субъединицы рибосом эукариотов - от 40 до 60S.
где М - молекулярный вес молекулы, R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, s - коэффициент седиментации молекулы, D - коэффициент диффузии молекулы, v - парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р - плотность растворителя.
Метод седиментациоиного равновесия. Определение молекулярных весов этим методом проводится при сравнительно небольших скоростях вращения ротора, порядка 7 000-8 000 об-мин -1 , чтобы молекулы с большим молекулярным весом не осаждались на дно. Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных - с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества "согласно формуле
где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, ю - угловая скорость, р - плотность растворителя, v - парциальный удельный объем, с х и с 2 - концентрация растворенного вещества на расстояниях г г и г 2 от оси вращения.
Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время - от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.
Метод приближения к седиментационному равновесию былразработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для "установления равновесия. С помощью этого метода можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию. Вначале макромолекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается. Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем сложных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам:
где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, v - парциальный удельный объем, р - плотность растворителя, dcldr - градиент концентрации макромолекулы, г м и г д - расстояние до мениска и дна пробирки соответственно, с м и с д - концентрация макромолекул у мениска и у дна пробирки соответственно, М м и M R -величины молекулярных весов, определенные по распределению концентрации вещества у мениска и дна пробирки соответственно.
2.8.2 Оценка чистоты препаратов
Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков. Чистота препаратов несомненно очень важна в тех случаях, когда требуется точно определить молекулярный вес молекулы. В большинстве случаев о гомогенности препарата можно судить по характеру границы седиментации, используя метод определения скорости седиментации: гомогенный препарат обычно дает одну резкоочерченную границу. Присутствующие в препарате примеси проявляются в виде дополнительного пика или плеча; они же обусловливают асимметрию основного пика.
2.8.3 Исследование конформационных изменений в макромолекулах
Еще одна область применения аналитического ультрацентрифугирования - исследование конформационных изменений макромолекул. Молекула ДНК, например, может быть одно- или двухцепочечной, линейной или кольцевой. Под действием различных соединений или при повышенных температурах ДНК претерпевает ряд обратимых и необратимых конформационных изменений, которые можно установить по изменению скорости седиментации образца. Чем компактнее молекула, тем меньше ее коэффициент трения в растворе и наоборот: чем менее она компактна, тем больше коэффициент трения и, следовательно, тем медленнее будет она седиментировать. Таким образом, различия в скорости седиментации образца до и после различных воздействий на него позволяют обнаруживать конформационные изменения, происходящие в макромолекулах.
У аллостерических белков, таких, например, как аспартат-транскарбамоилаза, конформационные изменения возникают в результате связывания их с субстратом и малыми лигандами. Диссоциацию белка на субъединицы можно вызывать, обработав его такими веществами, как мочевина или парахлормеркурибензоат. Все эти изменения легко можно проследить при помощи аналитического ультрацентрифугирования.
Формования трубчатых изделий методом центрифугирования . Под центрифугированием в промышленность строительных материалов... которых осуществляется такое воздействие, называются центрифугированием . В промышленности РБ используются горизонтальные центрифуги...
Осаждение частиц
Лабораторная работа >> ХимияКлеток, уже освобожденного низкоскоростным центрифугированием от ядра, митохондрий и... ультрацентрифугирование Особенности этого типа центрифугирования отражены в самом его... для нас примера использования центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, ...
Использование центрифуги
Курсовая работа >> Промышленность, производствоВ центрифугах периодического действия различные операции центрифугирования – загрузка, разделение, выгрузка – происходят... различают препаративное и аналитическое центрифугирование . При препаративном центрифугировании исходный биологический материал берут...
Центрифугирование - разделение неоднородных систем (напр., жидкость - твердые частицы) на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Приборы, применяемые для этой цели, называют центрифугами. Основной частью центрифуги является ротор с монтированными в нем гнездами для центрифужных пробирок. Ротор вращается с большой скоростью, вследствие чего создаются значительные по величине центробежные силы, под действием которых происходит разделение механических смесей, например осаждение взвешенных в жидкости частиц.
Центрифугирование применяется для отделения осадка от раствора, для отделения загрязненных жидкостей, производится также центрифугирование эмульсий (напр., сепарирование молока). Центрифугирование бетона применяется для увеличения его прочности. В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделения эритроцитовот плазмы крови,сгустков кровиотсыворотки, плотных частиц от жидкой части мочи и т. д.
Конструктивные особенности центрифуг заключаются в способе крепления к валу барабана и в пространственном его расположении. Все конструкции должны обеспечить, прежде всего, хорошую устойчивость ротора центрифуги. Поскольку вал приводит во вращение большую массу, он должен быть особенно устойчивым. Скорость вращения вала не должна равняться его критической скорости вращения, а должна быть больше или меньше ее. В первом случае вал называют гибким, во втором жёстким.
Препаративное центрифугирование - проводят с целью получения определенных компонентов из биологического материала для дальнейшего биохимического анализа. Такими компонентами могут быть клетки, их органеллы (митохондрии, рибосомы, ядра и др.) и макромолекулы (белки, ДНК и др.).
Аналитическое центрифугирование - проводят для выявления характеристик однородного материала, например, макромолекул. Материал центрифугируют, вследствие чего под контролем оптических систем происходит осаждение частиц. При этом можно определить их однородность, молекулярную массу, структуру, так как форма и масса частиц оказывают влияние на скорость осаждения. Проводя расчеты по стандартным формулам, можно вычислить эти параметры и составить характеристики исследуемого материала.
Ультрацентрифуга - прибор для разделения частиц размером менее 100 нм (коллоидов, субклеточных частиц, макромолекул белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов, синтетических полимеров и пр.), взвешенных или растворенных в жидкости. Это достигается вращением ротора, создающего центробежное поле с ускорением, на много порядков превышающим ускорение силы тяжести.
Аналитическое ультрацентрифугирование используют для исследования гомогенности (чистоты) препаратов биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов), а также для определения констант седиментации, молекулярной массы, констант ассоциации и размеров макромолекул. Ультрацентрифугирование применяется в медицине при клинической диагностике, для приготовления кровезаменителей и т.п.
